注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
Aluminum tert-butoxide3-硝基鄰苯二甲酸 96%環(huán)庚 97%

DPPH3-硝基鄰苯二甲酸 99%環(huán)庚酮 99%

2-Thiouracil吡唑 99%N,O-雙(*基硅烷基)乙酰胺 95%

Tungsten hexachloride亞硫酸鈣 90%N-(2-羥乙基)乙二胺 99%

TPTZ四乙基米氏酮 99%N-(2-羥乙基)乙二胺 CP

Paclitaxel米氏酮 98%α-糜蛋白酶 800 usp u/mg

EstradiolN-甲基二乙胺 98%α-糜蛋白酶 1000 usp u/mg

HMDSN-甲基二乙胺 99%胰蛋白酶（牛胰臟） potency ≥2500 units/mg

Phenanthrene2-(甲氨基)乙 99%胰蛋白酶（豬胰臟） 1：250

Barium oxide2，2'-硫代雙乙 99%胰蛋白酶（牛胰臟） potency ≥3000 units/mg

Sodium perborate tetrahydrate CP,97.0% （）聚 平均分子量 2.000

Sodium perborate mohydrate AR,99.0%（）聚 平均分子量 400

4-Iodophel氯甲酸異酯  97%聚 平均分子量 1000

4-Hydroxybiphenyl氯酯 98%（）聚 平均分子量 3000

TEG氯甲酸苯酯 98%聚 平均分子量 4000

Sodium ligsulfonate二酸 Standard for GC，>99.8%（T)3-氨基 99%

糊精;白糊精Toll-like Receptor 9 (D9M9H) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)Plastin L  淋巴細(xì)胞胞漿蛋白LCP1抗體

鹽酸芐達(dá)明SimpleChIP® Enzymatic Cell Lysis Buffers A & BPlasmigen  纖維蛋白溶酶原抗體

葡聚糖凝膠G-50;交聯(lián)葡聚糖G-50(中顆粒)SignalSilence® Rheb siRNA IIPLAP/Phospholipase A2 activator protein  磷脂酶A2激活蛋白抗體

葡聚糖凝膠G-50;交聯(lián)葡聚糖G-50(粗顆粒)PATL1/PAT1b (D8P1B) Rabbit mAbplant lectin B4/IB4  植物凝集素IB4

L-(+)-扁桃酸;S-扁桃酸Akt3 (E2B6R) Rabbit mAbPlakophilin 2  橋粒斑菲素蛋白2抗體

D-(-)-扁桃酸;R-扁桃酸T-Bet/TBX21 (D6N8B) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)Plakophilin 1  橋粒斑菲素蛋白1抗體

1-氨基海因鹽酸鹽;AHD，1-氨基乙內(nèi)酰脲鹽酸鹽Miz-1 (D7E8B) Rabbit mAbPLAGL2  多形性腺瘤基因樣蛋白2抗體

1-氨基海因鹽酸鹽（標(biāo)準(zhǔn)品）PSMD11 (D1T1R) Rabbit mAbPLAGL1/ZAC1  多型性腺瘤基因樣蛋白1抗體

人促腎上腺皮質(zhì)激素(1-24),替可克肽Gephyrin AntibodyPLAG1  多型性腺瘤基因1蛋白抗體

緩激肽T-Bet/TBX21 (D6N8B) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)PKN2  蛋白激酶N2抗體
馬紅球菌PCR檢測(cè)試劑盒廠家兔核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1克

兔核因子κB亞基p65親和肽(NF-κBp65)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT，避光100克

兔環(huán)磷酸腺苷(cAMP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：5毫克

兔肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：100毫克

兔基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：500克

兔基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A(MMP-2/GelatinaseA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT5克

兔結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白(Hpt/HP)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT10克

兔抗單核細(xì)胞抗體(AMA)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1公斤
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。