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注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
Potassium hydrogen phthalate苯肼 AR,98.0%燒堿石棉 CP，20-30目

Potassium bromide苯肼 CP,96.0%氫鈉 AR（）

Potassium carbonate鎢酸鈉 AR,99.5%亞硝酸鈷鈉 99.995% metals basis

Potassium carbonate sesquihydrate鎢酸鈉 CP,99.0%燒堿石棉 CP, 10-20目

Potassium chromate鎢酸鈉 99.995% metals basis鄰聯(lián)甲苯胺 AR，98%

Potassium dichromate鎢酸鈉 ACS, 99.0-101.0%鄰聯(lián)甲苯胺 CP，97%

Potassium hydroxide鎢酸 99%鄰聯(lián)甲苯胺 分析標準品,用于環(huán)境分析，≥99%（GC)

Potassium iodide氧化鉍 AR鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺 AR

Potassium tartrate hemihydrate氧化鉍 SP堿式碳酸鋅 AR,57.5%

Bismuth potassium iodide氧化鉍 99.9%甘氨酸 AR,99.5-100.5%

K-Lyte氧化鉍 99.99% metals basis甘氨酸鈉 98%

Potassium fluoaluminate氧化鉍 99.999% metals basis甘氨酸甲酯鹽酸鹽 99%

Potassium fluoborate硒粉 99.9% metals basis,200目甘氨酸乙酯鹽酸鹽 99%

Potassium titanium fluoride二氧化硒 AR，99%氟鋁酸 98.5%

Tripotassium phosphate trihydrate碲 99.99% metals basis氟硅酸 AR,99.0%

Potassium pyroantimonate4-二甲氨基吡啶 99%氟硅酸 99.999% metals basis

他唑巴坦鈉 (標準品)Rad23B (D4W7F) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/HRP  辣根過氧化物酶標記的兔抗生物素抗體IgG

D-環(huán)絲氨酸RIP3 (E1Z1D) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/Gold  膠體金標記的兔抗生物素抗體IgG

D-環(huán)絲氨酸(標準品)IFITM2 AntibodyRabbit Anti-Biotin/FITC  FITC標記的兔抗生物素抗體IgG

鹽酸四環(huán)素Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/Cy7  Cy7標記的兔抗生物素抗體IgG

鹽酸四環(huán)素(標準品)TRIB2 (D8P2X) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/Cy5.5  Cy5.5標記的兔抗生物素抗體IgG

嘌呤霉素Acetyl-Histone H4 (Lys16) (E2B8W) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/Cy5  Cy5標記的兔抗生物素抗體IgG

鈉/羧芐西林鈉n-phospho (Active) β-Catenin (Ser33/37/Thr41) (D13A1) Rabbit mAb (PE Conjugate)Rabbit Anti-Biotin/Cy3  Cy3標記的兔抗生物素抗體IgG

羧芐西林鈉(標準品)DAX1 (D2F1) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/Bio  生物素標記的兔抗生物素抗體IgG

芬苯達唑；苯硫咪唑PVR/CD155 (D3G7H) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/APC  APC標記的兔抗生物素抗體IgG

芬苯達唑；苯硫咪唑(標準品)Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/Ser5) (D1G3K) Rabbit mAbRabbit Anti-Biotin/AP  堿性磷酸酶（AP）標記的兔抗生物素抗體IgG
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