注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诎逯羞M(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?，分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。
Proteinase K莰烯  95%黃磷 GR（）

Proteinase K solution(+/-)-兒茶精 分析標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)氧乙酸 AR,18-20%

Pepstatin A(+/-)-兒茶精 96%過(guò)氧乙酸 21-25%

Rnasin Inhibitor（＋）－兒茶素  分析標(biāo)準(zhǔn)品，>98%過(guò)氧乙酸 26-30%

STI（＋）－兒茶素  98%過(guò)氧乙酸 31-35%

Aprotinin咖啡酸 分析標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)氧乙酸 36-40%

AMV Reverse transcriptase腦磷脂 98%，氬氣封裝過(guò)氧乙酸 41-45%

M-MLV Reverse transcriptase桂皮 分析標(biāo)準(zhǔn)品，99%過(guò)氧乙酸 46-50%

SuperScript II Reverse Transcriptase桂皮 98%過(guò)氧乙酸 高純度，醫(yī)用級(jí)，5%（1Gal/PE）

CIAP結(jié)晶紫 分析標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)氧乙酸 15-17%

Urease(jack bean)環(huán)庚烷 97%發(fā)煙硫酸 AR

Leupeptin(S)-(-)-β-香茅  99%發(fā)煙硫酸 65%

Thio-NAD檸檬酸 一  ≥99.9998% metals basis結(jié)晶四氯化錫 AR,99.0%  

β-DPN細(xì)胞松弛素B 98%結(jié)晶四氯化錫  99.995% metals basis

β-DPNH葉綠素b 95%硫脲 AR，99%

NADH Inhibitor4-氯苯甲 分析標(biāo)準(zhǔn)品硫脲 CP，98%

醋酸舍莫瑞林 Leptin receptor  瘦素受體（抗原）Snail/SNAI 1  Snail蛋白抗體

磺胺嘧啶銀Lpin1 protein  Lpin1 protein(抗原)SNAI2/SLUG  鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug抗體

磺胺嘧啶銀(標(biāo)準(zhǔn)品)Lumbrokinase  蚯蚓纖溶酶(蚓激酶抗原)SMYD4  組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD4抗體

辛伐他汀 Livin (Inhibitors of apoptosis proterins Livin)  一種新的凋亡抑制蛋白(抗原)SMYD3  組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3抗體

辛伐他汀,辛伐他?。?biāo)準(zhǔn)品）p38 MAPK/MKK3/MAPKK14  絲裂原活化蛋白激酶p38(抗原)SMYD2  組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2抗體

康普瑞汀磷酸二鈉鹽Metal ion transporter  擬南介金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(抗原)SMURF2  Smad蛋白E3泛素連接酶2抗體

硫酸西梭米星/硫酸西索霉素MADCAM-1  黏膜選址素（抗原）SMURF1  Smad蛋白E3泛素連接酶1抗體

硫酸西梭米星(標(biāo)準(zhǔn)品)MAG-a/b (Myelin associated glycoprotein; L / S -MAG;)  髓鞘相關(guān)糖蛋白a/b(抗原)SMS2/Sphingomyelin Synthase 2  鞘磷脂合成酶2抗體

生長(zhǎng)抑素MAG (Myelin associated glycoprotein; L-MAG;MAG-a )  髓鞘相關(guān)糖蛋白(抗原)Smoothened/SMO  跨膜蛋白Smoothened抗體

甲苯磺酸索拉非尼MMP-1(Mous ematrix metalloproteinases-1)  基質(zhì)金屬蛋白酶-1（小鼠抗原）SMOC2  分泌模塊化鈣結(jié)合蛋白2抗體（平滑肌相關(guān)蛋白2）
東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)人干擾素誘導(dǎo)蛋白10(IP-10/CXCL10)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1公斤

人干細(xì)胞因子/肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF/MGF)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1000只/袋

人干細(xì)胞因子受體(SCFR)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1包

人剛地弓形蟲(chóng)(T.gondii)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1000只/袋

人高爾基蛋白73(GP-73)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：25克

人高分子量細(xì)胞角蛋白(CK-HMW)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1塊

人高靈敏度促甲狀腺激素(U-TSH)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：RT1000只/袋

人高密度脂蛋白(HDL)ELISA試劑盒  *shēng huà shì jì  容量：1包
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。