實時
熒光-PCR法不僅具有普通PCR的高靈敏性,而且由于應用了熒光探針,可通過光電傳導系統(tǒng)直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結(jié)果,所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高準確性,克服了常規(guī)PCR的許多缺點。
熒光-PCR法反應體系中的引物和dNTP濃度:
1.定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。因脫鹽而除去的苯甲?;彤惗□;苌?,因此不會干擾PCR。部分應用需要純化,以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學的效率不是100%。這是個循環(huán)過程,在每個堿基加入時使用重復化學反應,使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物,尤其是大于50個堿基,截斷序列的比例很大,可能需要純化。
2.引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物,使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好,因為水的pH經(jīng)常偏酸,會引起寡核苷的水解。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月,但在室溫(15℃到30℃)僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年,在室溫(15℃到30℃)最多可以保存2個月。
3.引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產(chǎn)物擴增。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導或產(chǎn)生引物二聚體,過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計,可精確計算引物濃度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算:
X mol/L=OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)。
X:引物摩爾濃度,A、C、G、T:引物中4種不同堿基個數(shù)。
4.不要使用寡聚核苷酸作為標準,在EB染色的膠上估算引物濃度,因為引物和標準的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大。
5.dNTP溶液呈酸性,普通廠家的dNTP溶液一般均未調(diào)pH,應用1mol/l NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將dNTP貯存液pH調(diào)至7.0,以保證反應的pH值不低于7.1。再用紫外分光光度計定量。配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。多次凍融會使dNTP降解。
6.決定低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成,理論上在100μl反應體系中,4×dNTPs濃度若用20μmol/L,基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列,50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
7.在PCR反應中,dNTP應為50-200umol/L,當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。
8.dNTP含有磷酸根,能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。其濃度變化將影響Mg2+的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2+濃度。因此,在高濃度DNA及dNTP條件時,必須相應調(diào)整Mg2+的濃度。